Phân tích đột biến gien ATP7B ở bệnh nhân WILSON Việt Nam

Đỗ Thanh Hương[1], Tạ Thành Văn[2],  Nguyễn Văn Liệu[3], Hồ Cẩm Tú, Trần Vân Khánh

TÓM TẮT

Bệnh Wilson là bệnh di truyền gen lặn do đột biến gen ATP7B trên nhiễm sắc thể thường 13q14.3, liên quan đến chuyển hóa đồng. Tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới là 1/100.000 ÷ 1/35000 trẻ được sinh ra. Chẩn đoán và điều trị sớm bệnh có thể ngăn chặn được các biến chứng và hạn chế sự phát triển của bệnh. Đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu phát hiện các dạng đột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson. Xác định đột biến gen bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp 21 exon  gen ATP7B của 11 bệnh nhân Wilson được chẩn đoán theo thang điểm Ferenci.Kết quả đã phát hiện được 3 dạng đột biến mới chưa được công bố: c. 471C>A ® p. S105 stop, c. ins 47/48 CGGCG, c. ins-117/118 CGCCG;  3 dạng đột biến đã được công bố gây bệnh (T8501I, L1371P, c. insCGGCG -37/36) và 4 đột biến dạng SNP (V456L, K832R, V1140A, c -75C>A)

Từ khóa: Bệnh Wilson, gien ATP7B, đột biến gien, giải trình tự

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Wilson được biết đến là bệnh thoái hóa gan – nhân đậu, được tác giả Kinnear Wilson mô tả lần đầu tiên vào năm 1912. Cho đến nay, bệnh được phát hiện ở hầu hết các quốc gia và các chủng tộc trên thế giới với tỷ lệ mắc là 1/100.000 ÷ 1/35.000 trẻ sinh ra. Đây là bệnh di truyền, đột biến gien lặn trên nhiễm sắc thể thường 13q14.3, mã hóa gien ATP7B. Gien này có vai trò điều hòa quá trình hấp thu, phân bố và thải trừ đồng trong cơ thể. Do đó, khi đột biến gien xảy ra sẽ gây rối loạn quá trình chuyển hóa đồng đặc biệt là giảm bài tiết đồng qua đường mật. Lượng đồng ứ lại trong cơ thể sẽ lắng đọng dần trong các tổ chức: gan, não (chủ yếu ở nhân xám), mắt, da, thận, xương,… và gây ra các triệu chứng đa dạng trên lâm sàng. Nếu bệnh được chẩn đoán và điều trị sớm, có thể ngăn chặn được các biến chứng và hạn chế sự phát triển của bệnh^(1,5).

Ở Việt Nam, lần đầu tiên chúng tôi phát hiện 2 trường hợp bệnh nhân có đột biến gien Arg778Leu vào năm 2007⁽⁴⁾. Sau đó có một nghiên cứu giải trình tự exon 4-21ở bệnh nhi bị bệnh Wilson. Như vậy, số lượng nghiên cứu đột biến gien ATP7B ở Việt Nam còn hạn chế và chưa có nghiên cứu đầy đủ. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm phát hiện tất cả các dạng đột biến gien trên 21 exon ở các bệnh nhân bị bệnh Wilson Việt Nam.

ĐỐI T­ƯỢNG VÀ PH­ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu gồm 11 bệnh nhân được chẩn đoán bệnh Wilson theo thang điểm Ferenci⁽⁹⁾ (phụ lục 1, bảng 2),điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Trung Ương quân đội 108, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và bệnh Viện Nhi trung ương.

Phân tích gien được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gien-Protein, trường Đại học Y Hà Nội.Mẫu bệnh phẩm: 2ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.

Tách DNA từ máu ngoại vi và khuếch đại gien (PCR): DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn phần bằng phenol-chloroform-isopropanol (25:24:1). Toàn bộ 21 exon của gien ATP7Bđược khuếch đại với các cặp mồi đặc hiệu. Giải trình tự gien và phân tích đột biến: sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100 Gienetic Analyzer. Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISM ^TM 3100 – Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI. Các gien đột biến được so sánh trên ngân hàng gien: DNA (NG- 008806) và mRNA (NM- 000053).

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Các đặc điểm lâm sàng

Các bệnh nhân được chẩn đoán bệnh Wilson ở độ tuổi 6 – 53 tuổi. Trong đó có 7 bênh nhân nam và 4 bệnh nhân nữ.

Tất cả bệnh nhân đều có tổng số điểm WD≥ 4, theo thang điểm Ferenci⁽⁹⁾ (phụ lục 1). Các triệu chứng lâm sàng rất đa dạng với các biểu hiện triệu chứng tại gan, tại mắt và triệu chứng của hệ thần kinh. Dựa vào các triệu chứng của bệnh nhân chia thành 3 thể: 6 bệnh nhân thể gan đơn thuần, 4 bệnh nhân thể thần kinh đơn thuần, 2 bệnh nhân thể phối hợp gan và thần kinh

Kết quả giải trình tự gien

Chúng tôi phát hiện được 10 dạng đột biến trên các exon: 1,2,3,10,16 và 20. Trong đó exon 10 chiếm nhiều đột biến nhất 9/32; đột biến trên exon 1, 3, 16 là 5/32;  đột biến ở vị trí 5’ UTR là 4/32, đột biến trên exon 2 là 3/32 và trên exon 1 là 1/32 (Bảng 1) . Trong nghiên cứu của chúng tôi phát hiện được 3 đột biến mới chưa được công bố, đó là: c. 471C>A ® p. S105 stop, c. ins 47/48 CGGCG (Hình 1) và c. ins-117/118 CGCCG

                        Đột biến exon 1                                               Đột biến exon 3: p.Val456Leu (NDV)

Hình 1: Hình ảnh giải trình tự gien ATP7B exon 1 và exon 3 của bệnh nhân

Bảng 1.Đặc điểm lâm sàng và đột biến gien ATP7B

New: Đột biến mới; DV: Disease Variant (đột biến gây bệnh); SNP: Single Nucleotide Polymorphism (thể biến dị hay tính đa hình đơn nucleotide)

BÀN LUẬN

Thống kê từ các nghiên cứu trên thế giới cho thấy có hơn 300 dạng đột biến gien gây bệnh Wilson,  bao gồm các đột biến vô nghĩa, sai nghĩa, thêm hoặc bớt nucleotid gây lệch khung dịch mã protein⁽⁹⁾. Tần suất mắc các dạng đột biến khác nhau giữa các quốc gia và chủng tộc trên thế giới. Trong đó, dạng đột biến phổ biến nhất ở nhóm bệnh nhân Wilson khu vực châu Âu là đột biến H1069Q (C3270A) gây ra sự thay thế Histidine thành Glutamine thuộc vùng N của protein ATP7B. Đột biến Arg778Leu trên exon 8 của gien ATP7B đã được công bố là phổ biến nhất trong quần thể người châu Á. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi năm 2007 đã phát hiện 2 bệnh nhân mang đột biến này dạng dị hợp trong nhóm 29 bệnh nhân được phân tích gien⁽⁴⁾. Trong nhóm nghiên này (năm 2012-2013), chúng tôi phát hiện được 10 dạng đột biến và không tìm thấy đột biến Arg778Leu. Mỗi bệnh nhân có từ 2 dạng đột biến trở lên với các thể lâm sàng đa dạng. Những đột đột biến chúng tôi phát hiện được đều nằm trong vùng chức chức năng của protein ATP7B.

Hình 2: Sơ đồ các vùng chức chức năng của gien ATP7B⁽⁹⁾

Bệnh nhân số 1 thể thần kinh mang 2 đột biến dị hợp T850I trên exon 10 và L1371P trên exon 20, cả hai đột biến này đều được công bố là gây bệnh^(7,8). Như mô tả ở hình vẽ,  exon 10  nằm trong vùng  cấu trúc xuyên màng. Đột biến p.T850I làm thay đổi tính chất acid amin tại vị trí 850 và làm ảnh hưởng đến chức năng protein. Bệnh nhân này mang 2 đột biến dị hợp có thể cộng hưởng gây triệu chứng lâm sàng run tay, tăng trương lực cơ tứ chi và nói khó.

Bệnh nhân số 2 có đột biến p.V456L trên exon 3 được công bố là không gây bệnh (dạng SNP: Single Nucleotide Polymorphism hay là thể biến dị)⁽³⁾ và có thêm một đột biến mới chưa đươc công bố c.ins47/48 CGGCG trên exon 1. Đột biến acid amin vị trí 456 từ Valine thành Leucin đã được công bố là dạng đa hình thái. Sự thay đổi này không ảnh hưởng đến cấu trúc chức năng của protein. Đột biến thêm 5 nucleotide CGGCG tại exon 1, dạng dị hợp trong vùng mã hóa acid amin. Đột biến này gây lệch toàn bộ khung dịch mã, làm mất khả năng tổng hợp protein. Bệnh nhân này biểu hiện bệnh lúc 47 tuổi với triệu chứng nhức đầu, run chân tay, ceruloplasmin 4mg/dl. Nếu là thể đồng hợp có thể bệnh sẽ biểu hiện sớm hơn và nặng hơn.

Bệnh nhân số 3 có 2 đột biến: đột biến p.K832R dạng đa hình thái, trên exon 10⁽²⁾ và đột biến đồng hợp tử p.S105stop trên exon 2, tạo mã kết thúc sớm. Đây là dạng đột biến đồng hợp và mất gần như toàn bộ protein ATP7B nên triệu chứng thần kinh nặng và ceruloplasmin thấp 1mg/dl.

Bệnh nhân số 4 cũng biểu hiện lâm sàng thần kinh nặng và cùng mang đột biến p. S105stop dạng đồng hợp trên exon 2 giống bệnh nhân số 3.

Bệnh nhân số 5 mang 4 đột biến, trong đó có 3 được công bố là dạng đa hình thái, đó là:  p.K832R, p.V456L và p.V1140A^(2,3,6). Ngoài ra, bệnh nhân này còn có thêm một đột biến đồng hợp c.ins -118/117 CGGCG ở vùng 5’ UTR. Đây là vùng giàu G/C, thường dễ bị biến đổi trong quá trình phiên mã và có thể là đột biến mới gây bệnh do làm lệch vị trí của mã mở đầu, gây sai lệch toàn bộ khung dịch mã của gien ATP7B ở phía sau. Bệnh nhân này có biểu hiện tăng men gan, run tay và tăng trương lực cơ.

Bệnh nhân số 6 có 2 đột biến dạng SNP (p.V456L và p.K832R)^(2,3), có một đột biến mới c.ins -117/118 CGCCG. Đột biến mới dạng đồng hợp tử gây bệnh do làm lệch khung dịch mã. Bệnh nhân này cũng có biểu hiện viêm gan và tổn thương não giống bệnh nhân số 5.

Bệnh nhân số 7 được chẩn đoán bệnh Wilson thể gan, có 3 đột biến: đột biến p.V456L dạng SNP⁽³⁾, đột biến gây bệnh p.T850I dạng dị hợp⁽⁸⁾ và đột biến mới c.ins -117/118 CGCCG dạng dị hợp ở vùng 5’ UTR. Bệnh nhân này cũng mang đột biến p.T850I giống bệnh nhân số 1 thể thần kinh nhưng 2 bệnh nhân này có thêm các dạng đột biến khác kèm theo. Như vậy sự kết hợp các đột biến khác nhau có thể tạo ra các thể lâm sàng khác nhau.

Bệnh nhân số 8 cùng thể gan và mang 2 đột biến giống bệnh nhân số 7: đột biến gây bệnh T850I dạng dị hợp⁽⁸⁾ và đột biến mới c.ins -117/118 CGCCG dạng dị hợp ở vùng 5’ UTR.

Bệnh nhân số 9 thể gan có 4 đột biến: c. -75C>A, p.V456L, p.K832R và c. ins -117/118 CGGCG. Trong đó chỉ có đột biến c. ins -117/118 CGGCG dạng đồng hợp ở vùng 5’ UTR là có khả năng gây bệnh do làm lệch khung dịch mã, còn các đột biến khác được công bố là không gây bệnh và chỉ là dạng SNP^(2,3,10).

Bệnh nhân số 10 thể gan có một đột biến p.K832R dạng SNP⁽²⁾ và 1 đột biến p. S105stop có khả năng gây bệnh do tạo thành mã kết thúc sớm làm mất gần như hoàn toàn protein ATP7B. Bệnh nhân này mang đột biến dạng dị hợp với xơ gan nặng cùng với giảm tỷ lệ prothrombin và giảm tiểu cầu.

Bệnh nhân số 11 thể gan có 3 đột biến: đột biến p.V456L dạng đa hình thái⁽³⁾, đột biến p.T850I dạng dị hợp⁽⁸⁾ và đột biến mới c.ins 47/48 CGGCG dạng dị hợp đều có khả năng gây bệnh. Với sự cộng hưởng của 3 đột biến dạng dị hợp gây nên tổn thương xơ gan.

Như vậy đột biến gien gây bệnh Wilson trên gien ATP7B có rất nhiều dạng, trên cùng một bệnh nhân có thể có nhiều đột biến dị hợp khác nhau tạo nên các thể lâm sàng đa dạng. Đặc điểm này cho thấy tính đa hình của các bệnh lý di truyền gien lặn trên nhiễm sắc thể thường.

KẾT LUẬN

Bệnh Wilson là bệnh có các thể lâm sàng đa dạng với rất nhiều dạng đột biến khác nhau trên cùng một bệnh nhân. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã phát hiện được 3 dạng đột biến mới chưa được công bố, đó là: c. 471C>A ® p. S105 stop, c. ins 47/48 CGGCG, c. ins-117/118 CGCCG;  3 dạng đột biến đã được công bố gây bệnh (p.T8501I, p.L1371P, c. insCGGCG -37/36) và 4 đột biến dạng đa hình thái (p.V456L, p.K832R, p.V1140A, c -75C>A).

Cần tiến hành nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để tìm mối tương quan giữa kiểu hình và kiểu gien cũng như phát hiện sớm đột biến cho gia đình bệnh nhân để chẩn đoán và điều trị sớm cho họ.

Bảng 2: Thang điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo Ferenci⁽⁹⁾

ANALYSIS MUTATION OF WILSON DISEASE PATIENTS IN VIETNAM

ABSTRACT

Wilson disease (WD) is disorder of copper metabolism caused by an autosomal recessive mutation 13q14.3 in ATP7B gene. The prevelance of WD in the world is about 1 in 100.000 to  1 in 35.000 live births. Early detection of WD and right treatment helps prevent complication and development of the disease, therefore avoiding death of the patients. The aim of this study was to identify ATP7B gene mutation features for Wilson’s disease in Vietnam. 11 patients with confirmed WD by Ferenci scale were analyzed by direct sequencing of exons 1-21 of ATP7B gene.Wilson’s disease has many clinical types with various mutations in ATP7B gene.Three new discoveredmutations have not been published: c. 471C>A ® p. S105 stop, c. ins 47/48 CGGCG, c. ins-117/118 CGCCG.  Three identified disease-causingmutations are T8501I, L1371P, c. insCGGCG -37/36. In addition the SNP V456L, K832R, V1140A, c -75C>A.This study should be performed with more patients to define the genotype phenotype correlation

Keywords: Wilson’s disease, ATP7B gene, mutation, sequencing.

1.   A.B. Shah, I. Chernov, H.T. Zhang, B.M. Ross, K. Das, S. Lutsenko, Identification and analysis of mutations in the Wilson disease gene (ATP7B): population frequencies, genotype-phenotype correlation, and functional analyses. Am J Hum Genet. 61 (1997) 317.
2.  G.R. Thomas, J.R. Forbes, E.A. Roberts, J.M. Walshe, D.W. Cox, The Wilson disease gene: spectrum of mutations and their consequences. Nat Genet. 9 (1995) 210.

1. Brage A, Tome S, Garcia A, et al. Clinical and molecular characterization of Wilson disease in Spanish patients. Hepatol Res. 2007;37:18-26.
2. Curtis D, Durkie M, Balac P, et al. A study of Wilson disease mutations in Britain. Human mutation.1999;14:304-311.
3. Đỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Vân Anh (2007) “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và bước đầu phát hiện đột biến gien gây bệnh Wilson”. Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ nội trú bệnh viện.

1. Gupta A. et al. Molecular pathologienesis of Wilson disease among Indians: a perspective  on mutation spectrum in ATP7B giene, prevalent defects, clinical heterogieneity an  implication towards diagnosis. Cellular and molecular neurobiology. 2007; 37:1023-1033.
2. Mak CM, Lam CW, Tam S, et al. Mutational analysis of 65 Wilson disease patients in Hong Kong Chinese: identification of 17 novel mutations and its gienetic heterogieneity. Journal of human gienetics. 2008;53:55-63.
3. Michael D. Bates, Nicholas P. Matarazzo:  Different Types of Anorectal Malformations Are Associated with Different Combinations of Other Congienital Anomalies (2009). Conference on Clinical Research for Rare Diseases
4. Peter Ferenci (2006). “Regional distribution of mutations of the ATP7B giene in patients with Wilson disease: impact on gienetic testing”. Hum Gienet. 120, 151–159
5. Santhosh S. et al. ATP7B mutations in families in a predominantly Southern Indian cohort of Wilson’s Disease patients. Indian J. Gastroenterol. 2006;25:277-282
6. Wu ZY, Wang N, Lin MT, et al. Mutation analysis and the correlation between gienotype and phenotype of Arg778Leu mutation in chinese patients with Wilson disease. Archives of neurology. 2001;58:971-976.